Ziehl-Neelsen-Fleck-Stiftung, Reagenzien und Technik

Die Ziehl-Neelsen-Färbung in einer Färbungstechnik, um alkoholsäureresistente Mikroorganismen (AAR) zu identifizieren. Der Name dieses mikrobiologischen Verfahrens bezieht sich auf seine Autoren: den Bakteriologen Franz Ziehl und den Pathologen Friedrich Neelsen.

Diese Technik ist eine Art von differentieller Färbung, die die Verwendung verschiedener Farbstoffe impliziert, um einen Kontrast zwischen den Strukturen zu erzeugen, die Sie beobachten, differenzieren und später identifizieren möchten. Die Ziehl-Neelsen-Färbung dient zur Identifizierung bestimmter Arten von Mikroorganismen.

Einige dieser Mikroorganismen sind Mykobakterien (zum BeispielMycobacterium tuberculosis), nocardias (zum BeispielNocardia sp.) und einige einzellige Parasiten (zum BeispielCryptosporidium parvum). Viele der Bakterien können durch eine übliche Technik namens Gram-Färbung klassifiziert werden.

Einige Bakteriengruppen benötigen jedoch andere Methoden, um sie zu identifizieren. Techniken wie die Ziehl-Neelsen-Färbung erfordern Kombinationen von Farbstoffen mit Wärme, um die erste an der Zellwand zu fixieren.

Dann folgt ein Entfärbungsprozess, der zwei Ergebnisse zulässt: Resistenz oder Empfindlichkeit gegenüber Verfärbungen durch Säuren und Alkohole.

Index

• 1 Stiftung
  • 1.1 Sekundärfärbung
• 2 Reagenzien
  • 2.1 Primärfärbung
  • 2.2 Entfärbungslösung
  • 2.3 Sekundärfärbung (Antifärbemittel)
• 3 Technik
  • 3.1 Säurefestes Färbeverfahren
• 4 Referenzen

Stiftung

Die Grundlage dieser Färbetechnik basiert auf den Zellwandeigenschaften dieser Mikroorganismen. Die Wand wird von einer Art von Fettsäuren gebildet, die Mykolsäuren genannt werden; Diese zeichnen sich durch sehr lange Ketten aus.

Wenn Fettsäuren sehr lange Strukturen haben, können sie Farbstoffe leichter zurückhalten. Einige Gattungen von Bakterien sind aufgrund des hohen Mycolsäuregehalts der Zellwand sehr schwer durch Gramfärbung zu färben.

In der Ziehl-Neelsen-Färbung wird die Phenolverbindung Carbolfuchsin, ein basischer Farbstoff, verwendet. Dies hat die Fähigkeit, mit Fettsäuren in der Zellwand, die bei Raumtemperatur wachsartig texturiert ist, zu interagieren.

Die Karbolfuchsin-Färbung wird in Gegenwart von Wärme verbessert, weil das Wachs schmilzt und die Farbstoffmoleküle sich schneller in die Zellwand bewegen.

Die Säure, die später verwendet wird, dient dazu, die Zellen zu verfärben, die nicht gefärbt waren, weil ihre Wand nicht ausreichend mit dem Färbemittel verwandt war; daher ist die Stärke des Säurefärbemittels in der Lage, den Säurefarbstoff zu entfernen. Die Zellen, die dieser Verfärbung widerstehen, werden als säurebeständig bezeichnet.

Sekundäre Färbung

Nach der Verfärbung der Probe wird dies einem anderen Farbstoff, der als Sekundärfarbstoff bezeichnet wird, gegenübergestellt. In der Regel wird Methylenblau oder Malachitgrün verwendet.

Der sekundäre Farbstoff färbt das Hintergrundmaterial und schafft somit einen Kontrast zu den Strukturen, die im ersten Schritt gefärbt wurden. Nur die gebleichten Zellen absorbieren den zweiten Farbstoff (Antiflecken) und nehmen ihre Farbe an, während säurefeste Zellen die rote Farbe behalten.

Dieses Verfahren wird häufig zur Identifizierung von Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium leprae, die säurefeste Bazillen genannt werden.

Reagenzien

Primäre Färbung

Carboxin 0,3% Fuchsin (filtriert) wird verwendet. Dieser Farbstoff wird aus einem Gemisch von Alkoholen hergestellt: Phenol in Ethanol (90%) oder Methanol (95%), und in diesem Gemisch werden 3 Gramm basisches Fuchsin gelöst.

Entfärbungslösung

In diesem Schritt können Lösungen von 3% iger Alkoholsäure oder 25% iger Schwefelsäure verwendet werden.

Sekundärfärbung (Anti-Colorant)

Der Farbstoff, der am häufigsten verwendet wird, um den Kontrast in den Proben durchzuführen, ist üblicherweise 0,3% Methylenblau. Sie können jedoch auch andere verwenden, z. B. 0,5% Malachitgrün.

Technik

Säurefestes Färbeverfahren

Bereiten Sie einen bakteriellen Abstrich vor

Diese Vorbereitung erfolgt auf einem sauberen und trockenen Objektträger, wobei die Sterilität beachtet wird.

Trocknen Sie den Abstrich

Lassen Sie den Abstrich bei Raumtemperatur trocknen.

Erhitze die Probe

Die Probe muss erhitzt werden, indem auf den Objektträger Feuer angewendet wird. Eine Fixierung mit Alkohol kann durchgeführt werden, wenn der Abstrich nicht mit Sputum zubereitet wurde (mit Natriumhypochlorit behandelt, um es aufzuhellen) und wenn es nicht sofort gefärbt wird.

M. Tuberkulose Es wird mit Bleichmittel und während des Färbeprozesses beseitigt. Thermofixierung von unbehandeltem Sputum wird nicht abtöten M. Tuberkulose, während die Fixierung mit Alkohol bakterizid ist.

Bedecke den Fleck

Der Fleck wird mit der Karbolfuchsin-Lösung (primäre Grundfarbe) bedeckt.

Erhitze den Fleck

Dies geschieht für 5 Minuten. Sie sollten eine Dampfabgabe bemerken (ca. 60 ° C). Es ist wichtig, die Probe nicht zu überhitzen und zu vermeiden.

Im Hinblick auf die Erhitzung des Flecks muss beim Erhitzen des Karbolfuchsins besonders vorsichtig vorgegangen werden, insbesondere wenn die Färbung auf einem Tablett oder einem anderen Behälter durchgeführt wird, in dem hochentzündliche Chemikalien aus der vorherigen Färbung gesammelt wurden.

Unter den Objektträgern sollte nur eine kleine Flamme mit einem angezündeten Tupfer aufgetragen werden, der vorher mit ein paar Tropfen Alkohol, Methanol oder 70% Ethanol getränkt wurde. Vermeiden Sie die Verwendung eines großen in Ethanol getränkten Tupfers, da dies eine Brandgefahr darstellt.

Wasche den Fleck

Diese Wäsche sollte mit sauberem Wasser erfolgen. Wenn das Leitungswasser nicht sauber ist, waschen Sie den Abstrich vorzugsweise mit gefiltertem oder destilliertem Wasser.

Bedecken Sie den Abstrich mit saurem Alkohol

Dieser Säurealkohol sollte bei 3% liegen. Die Abdeckung erfolgt für 5 Minuten oder bis der Ausstrich ausreichend entfärbt ist, dh blass rosa.

Es ist zu beachten, dass saurer Alkohol brennbar ist; Daher sollte es sehr sorgfältig verwendet werden. Vermeiden Sie, sich in der Nähe von Zündquellen zu befinden.

Wasche den Fleck

Die Wäsche sollte mit sauberem, destilliertem Wasser erfolgen.

Bedecken Sie den Abstrich mit Farbstoff

Es kann für 1 oder 2 Minuten grüner Malachit (0,5%) oder Methylenblau (0,3%) Farbstoff sein, wobei die längste Zeit verwendet wird, wenn der Schmierfilm dünn ist.

Wasche den Fleck

Wiederum muss sauberes Wasser (destilliert) verwendet werden.

Abtropfen lassen

Die Rückseite des Objektträgers sollte gereinigt werden, und der Fleck sollte auf ein Entwässerungsregal gelegt werden, so dass es luftgetrocknet ist (verwenden Sie kein absorbierendes Papier zum Trocknen).

Untersuche den Abstrich unter dem Mikroskop

Das 100X Objektiv und das Immersionsöl sollten verwendet werden. Scannen Sie den Schmierstich systematisch und notieren Sie die relevanten Beobachtungen.

Interpretieren Sie die Ergebnisse

Theoretisch gelten Mikroorganismen, die rötlich gefärbt sind, als säurefest positiv (AAR +).

Im Gegensatz dazu, wenn die Mikroorganismen in Abhängigkeit von dem als Gegenfarbstoff verwendeten Farbstoff blau oder grün gefärbt sind, werden sie als negative alkoholresistente Säure (AAR-) betrachtet.

Referenzen

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